Lacticaseibacillus rhamnosus GG probiyotik bakterisinin fenolik bileşik olan karvakrol ile etkileşimi ve proteomik yöntemler ile analizi

Abstract

Bu tez çalışmasında, fenolik bileşiklerden biri olan karvakrolün, yaygın ve iyi bilinen probiyotik bir bakteri olan Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir. Hipotez olarak; birçok gıdada doğal olarak bulunan karvakrolün, LGG'nin probiyotik özelliklerinin gelişimine ve proteomik profiline katkı sağlayabileceği öne sürülmüştür. Bu doğrultuda, probiyotik bakteriler ve fenolik bileşiklerin, aynı ekosistem içinde birlikte bulunmalarından hareketle, aralarında gelişebilecek sinbiyotik ilişkinin bakterinin fizyolojik özellikleri ve protein düzeyindeki etkilerini anlamak amaçlanmıştır. Çalışmada LGG suşu, 0-800 µg/mL aralığında karvakrol konsantrasyonları ile muamele edilmiştir. Minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değeri ?800 µg/mL olarak belirlenmiş ve bu nedenle 25, 50, 100, 200 ve 300 µg/mL konsantrasyonları deneysel analizler için seçilmiştir. Deney bulguları, karvakrolün hiçbir konsantrasyonda LGG üzerinde inhibe edici etki göstermediğini ve bazı konsantrasyonlarda bakteriyel büyümeyi desteklediğini göstermiştir. Oto-agregasyon testlerinde 300 µg/mL karvakrol konsantrasyonunda LGG'nin oto-agregasyon özelliğinde %22'ye varan artış gözlemlenmiştir. Ko-agregasyon analizlerinde, karvakrolün LGG'nin E. coli ve S. aureus ile etkileşiminde saat ve konsantrasyona bağlı olarak değişen etkiler saptanmıştır. Özellikle 200 µg/mL karvakrol konsantrasyonunda LGG'nin S. aureus ile ko-agregasyonu %22 oranında artmıştır. Antioksidan aktivite analizlerinde, karvakrol tek başına DPPH ve ABTS testlerinde yüksek antioksidan kapasite gösterirken, LGG'nin karvakrol ile birlikte büyütülmesinin antioksidan aktiviteyi anlamlı şekilde artırmadığı görülmüştür. Benzer şekilde, LGG'nin adezyon kabiliyeti özellikle 200 µg/mL karvakrol konsantrasyonunda %11 oranında artış göstermiştir. Safra tuzuna dayanıklılık testlerinde, LGG kontrol grubunda %94 direnç gösterirken, karvakrol ile muamele edilen gruplarda bu oran %75 ile %93 arasında değişmiş, ancak genel olarak karvakrolün dayanıklılığı artırmadığı gözlenmiştir. Pepsin direnci açısından ise tüm karvakrol konsantrasyonlarında düşüş tespit edilmiştir. BSH enzim analizinde karvakrol ile tüm konsantrasyonlarda enzim aktivitesinde artış gözlemlenmiştir. Proteomik analizlerde ise, karvakrolün "CHAP domain-containing protein" ve "UPF0291 protein AWJ15_03705" protein düzeylerinde değişikliğe sebep olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak, karvakrolün LGG bakterisinin bazı probiyotik özellikleri üzerinde destekleyici etkiler gösterebildiği, bazı parametrelerde ise nötr ya da hafif baskılayıcı etkiler oluşturduğu görülmüştür. Bu bulgular, fenolik bileşiklerin probiyotiklerle birlikte kullanımının sinbiyotik etkileşim bağlamında yeniden değerlendirilmesi gerektiğini ortaya koymaktadır. Ayrıca bu çalışma, karvakrolün LGG'nin proteomu üzerindeki olası etkilerine dair temel bir bakış açısı sunmakta olup, gelecekte yapılacak daha kapsamlı proteomik analizler için öncü bir nitelik taşımaktadır.In this thesis study, the effects of carvacrol, a phenolic compound commonly found in many food sources, on the widely known probiotic bacterium Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) were evaluated. The central hypothesis posits that carvacrol may contribute to the enhancement of LGG's probiotic properties and potentially influence its proteomic profile. Based on the coexistence of probiotic bacteria and phenolic compounds in the same ecosystem (e.g., the gut microbiota), this study aimed to investigate the interaction between these two health-promoting food components and to elucidate how the synbiotic relationship they may form affects the physiological properties and proteome of the probiotic bacteria. In the experimental design, LGG was treated with carvacrol concentrations ranging from 0 to 800 µg/mL. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined to be ?800 µg/mL, and therefore, 25, 50, 100, 200, and 300 µg/mL concentrations were selected for further analysis. The results showed that carvacrol did not exhibit any inhibitory effects on LGG at the tested concentrations and, in some cases, even supported bacterial growth. In auto-aggregation assays, a 22% increase in LGG's auto-aggregation ability was observed at 300 µg/mL carvacrol. Co-aggregation analyses revealed time- and concentration-dependent changes in the interaction between LGG and E. coli or S. aureus. Notably, co-aggregation with S. aureus increased by approximately 22% at 200 µg/mL carvacrol. Antioxidant activity tests showed that carvacrol alone had strong antioxidant capacity in both DPPH and ABTS assays; however, growing LGG in the presence of carvacrol did not significantly enhance the antioxidant activity. Similarly, the adhesion ability of LGG was increased 11% by 200 µg/mL carvacrol. In bile salt tolerance tests, the LGG control group demonstrated 94% resistance, while the treated groups ranged between 75% and 93%, suggesting that carvacrol generally did not enhance bile salt tolerance. Regarding pepsin resistance, a decrease was observed at all tested carvacrol concentrations. In the BSH enzyme analysis, an increase in enzyme activity was observed at all concentrations of carvacrol. In the proteomic analysis, carvacrol altered the abundancies of "CHAP domain-containing protein" and "UPF0291 protein AWJ15_03705" among the detected spots. In conclusion, carvacrol was found to support certain probiotic characteristics of LGG while exhibiting neutral or mildly suppressive effects on others. These findings suggest that the use of phenolic compounds in combination with probiotics should be re-evaluated in the context of synbiotic interactions. Furthermore, this study provides a foundational perspective on the potential impact of carvacrol on the proteome of LGG and serves as a preliminary framework for future comprehensive proteomic analyses.