Rekombinant PKM1 proteininin üretimi ve saflaştırılması: şaperon sistemlerinin kullanımı

Abstract

Rekombinant protein üretiminde en yaygın kullanılan ekspresyon sistemi Escherichia coli (E. coli)'dir. Bu bakteri, hızlı çoğalma kapasitesi, düşük maliyetli kültür koşulları ve yüksek düzeyde protein ekspresyonu sağlaması nedeniyle tercih edilmektedir. Bununla birlikte, E. coli sitoplazmasında üretilen heterolog proteinler sıklıkla yanlış katlanmakta ve çözünmeyen inklüzyon cisimcikleri halinde birikmektedir. Bu agregatlar biyolojik olarak inaktif olup genellikle anormal disülfit bağları ve olağandışı serbest sistein kalıntıları içermektedir. İnklüzyon cisimciklerinden fonksiyonel proteinin yeniden kazanımı teorik olarak mümkün olsa da endüstriyel ölçekte bu süreç zaman ve maliyet açısından verimli değildir. Dolayısıyla rekombinant proteinlerin, özellikle enzimlerin E. coli hücrelerinde çözünür ve biyolojik olarak aktif formda üretimini sağlayacak yöntemlerin geliştirilmesi günümüzde moleküler biyoloji ve biyoteknoloji alanlarında öncelikli araştırma konularından biri olarak öne çıkmaktadır. Pirüvat kinaz (PK), glikolizin son basamağında görev yapan ve fosfoenolpirüvat ile ADP'nin pirüvat ve ATP'ye dönüşümünü katalizleyen hız sınırlayıcı bir enzimdir. Memelilerde PKM1, PKM2, PKL ve PKR olmak üzere dört farklı izoform tanımlanmıştır. Kas ve beyin gibi yüksek enerji ihtiyacı olan dokularda PKM1 izoformu eksprese edilirken, PKM2 izoformu kanser hücrelerinde farklı aktivite düzeyleri ile tümör gelişiminde rol oynamaktadır. PKL izoformu karaciğerde, PKR izoformu ise eritrositlerde yüksek düzeyde eksprese edilmektedir. Enerji metabolizmasının sürdürülebilirliğinde kritik rol üstlenen PKM1'in rekombinant üretimi hem temel biyokimyasal araştırmalar hem de biyomedikal uygulamalar açısından önem taşımaktadır. Bu çalışmada, PKM1'in E. coli hücrelerinde çözünür formda ve yüksek verimlilikle üretilebilmesi için çeşitli stratejiler değerlendirilmiştir. Protein katlanmasını kolaylaştıran sitoplazmik şaperon sistemlerini (DnaK/DnaJ/GrpE, GroEL/GroES ve Trigger Faktör) içeren pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2 ve pTf16 plazmitleri kullanılmıştır. Ayrıca BL21, C41 ve Origami suşlarında şaperonların etkileri karşılaştırılmış ve farklı indüksiyon parametreleri optimize edilmiştir. Elde edilen sonuçların, PKM1'in fonksiyonel ve çözünür formda üretimine katkı sağlamasının yanı sıra, diğer rekombinant proteinlerin yüksek verimli ekspresyonuna da yol gösterici olacağı öngörülmektedir. Böylelikle bu çalışma, ekspresyon sistemlerinde şaperon destekli protein üretiminin optimizasyonuna yönelik önemli bir katkı sunmakta ve biyomedikal araştırmalarda kullanılabilecek yeni yaklaşımların geliştirilmesi için temel oluşturmaktadır.Recombinant protein production most commonly employs the Escherichia coli (E. coli) expression system. This bacterium is preferred due to its rapid proliferation capacity, low cost culture conditions, and its ability to provide high levels of protein expression. However, heterologous proteins produced in the cytoplasm of E. coli often misfold and accumulate as insoluble inclusion bodies. These aggregates are biologically inactive and generally contain abnormal disulfide bonds and unusual free cysteine residues. Although the recovery of functional protein from inclusion bodies is theoretically possible, this process is not efficient in terms of time and cost at an industrial scale. Therefore, the development of methods that will enable the production of recombinant proteins, especially enzymes, in a soluble and biologically active form in E. coli cells has emerged today as one of the priority research topics in the fields of molecular biology and biotechnology. Pyruvate kinase (PK) is a rate-limiting enzyme that functions in the final step of glycolysis and catalyzes the conversion of phosphoenolpyruvate and ADP into pyruvate and ATP. In mammals, four different isoforms have been identified: PKM1, PKM2, PKL, and PKR. While the PKM1 isoform is expressed in tissues with high energy demand such as muscle and brain, the PKM2 isoform plays a role in tumor development with different activity levels in cancer cells. The PKL isoform is expressed at high levels in the liver, whereas the PKR isoform is expressed at high levels in erythrocytes. The recombinant production of PKM1, which plays a critical role in the sustainability of energy metabolism, is important for both basic biochemical research and biomedical applications. In this study, various strategies were evaluated in order to enable the production of PKM1 in a soluble form and with high efficiency in E. coli cells. Cytoplasmic chaperone systems that facilitate protein folding (DnaK/DnaJ/GrpE, GroEL/GroES, and Trigger Factor), carried on the plasmids pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2, and pTf16, were used. In addition, the effects of chaperones were compared in BL21, C41, and Origami strains, and different induction parameters were optimized. The obtained results are expected to contribute to the production of PKM1 in a functional and soluble form, as well as to provide guidance for the high-yield expression of other recombinant proteins. Thus, this study makes an important contribution to the optimization of chaperone-assisted protein production in expression systems and lays the groundwork for the development of new approaches that can be used in biomedical research.