Biyoetanol üretimi için thermotoga naphthophila’dan β-ksilanazın moleküler klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu

Abstract

Enzimler, üretim aşamasının kolay ve ucuz olmasından dolayı çeşitli biyoteknolojik uygulamalarda kullanılabilmektedir. Ksilanaz enzimleri özellikle endüstriyel alanlarda çok tercih edilmesinden dolayı bu enzim üzerinde yapılan araştırmalar oldukça fazladır. Bu çalışmada β-ksilanaz geni, termofilik bir Organizma olan Thermotoga naphthophila’dan klonlandı. Ekspresyon vektörü pET-21a(+) aracılığı ile Escherichia coli BL21(DE3)’te eksprese edildi. Yapılan araştırmalar sonucu enzimin pH (7.0), sıcaklık (37°C) ve IPTG konsantrasyonu (0,5 mM) en yüksek ekspresyon sonucunu verecek şekilde ayarlandı. β ksilanazın saflaştırılması ısıl işlem kullanılarak gerçekleştirildi. Enzimin indirgen şeker miktarının saptanması için Dinitrosalisilik asit (DNS) kullanıldı. Yöntem indirgen şekerin 3,5-Dinitrosalisilik asit ile yükseltgenmesine dayanır. Saflaştırılmış β-ksilanaz enziminin moleküler kütlesi sodyum dodesil sülfat (SDS) poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak 38 kDa olduğu bulundu β-ksilanaz enzimi fındık koçanı, ormangülü dalı ve ormangülü yaprağı lignoselülozik biyokütleler ile ön muamele aşamasından geçirildi. Pek çok ön işlem yöntemi araştırıldı ve en iyi sonucu verebilecek yöntem olan asit alkali metodu kullanıldı. Biyokütlelerin enzimle muamelesi sonucu açığa çıkardığı şeker miktarı hesaplandı. En yüksek aktivite fındık koçanı biyokütlesinde olduğu gözlemlendi. Çeşitli kullanım alanları bulunan termofilik β-ksilanaz enziminin biyokütleler ile muamele edilmesinin ardından fermentasyon aşamasının ve diğer metodların uygulanması durumunda fosil yakıtların yerini alabileceği ve yenilenebilir enerji kaynağı olarak biyoetanol üretilebileceği öngörülmektedir.

Enzymes can be used in various biotechnological applications due to the easy and cheap production stage. Since xylanase enzymes are preferrend especially in industrial areas, researches on this enzyme are quite high. In this study, the β-xylanase gene was cloned from Thermotoga naphthophila, a thermophilic organism. The expression vector was expressed in Escherichia coli BL21(DE3) via pET-21a (+). Within the literature information, pH (7.0), temperature (37°C) and IPTG concentration (0,5 mM) of the enzyme were adjusted to result in the highest expression. Dinitrosalicylic acid (DNS) was used to determine the amount of reducing sugar of the enzyme. The molecular mass of the purified β-xylanase enzyme was found to be 38 kDa using sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis. The β-xylanase enzyme hazelnut cob, rhododendron branch and rhododendron leaf were pretreated with lignocellulosic biomass. Many pretreatment methods have been researched and the acid alkali method which can give the best results, has been used. The amount of sugar released by enzyme treatment of biomass was calculated. The highest activity was observed in hazelnut cob biomass. It is envisaged that after the thermophilic β-xylanase enzyme, which has various uses, is treated with biomass, fermentation stage and other methods can replace fossil fuels and produce bioethanol as a renewable energy source.